تولید و تخلیص جزیی آنزیم کاتالاز از باکتری بومی kocuria asb 107 مقاوم به پرتوهای یونیزان

انواع اکسیژن فعال به ویژه h2o2 غالبا طی فرایند های متابولیکی درون سلولی، به ویژه تنفس هوازی و یا تحت تاثیر عوامل محیطی در داخل سلول ایجاد می شوند و یا ممکن است در محیط اطراف سلول حضور داشته باشند.. از طرف دیگر، h2o2 به عنوان ماده ی سفید کننده و یا از بین برنده ی میکروارگانیسم ها در صنایع غذایی، نساجی، بهداشتی و... استفاده ی گسترده ای دارد؛ اما به سبب اثر سمی آن بر روی محیط زیست و سلامت انسان، لازم است که در فرایندهای نهایی صنعتی حذف شود. کاتالاز (h2o2- h2o2 oxidoreductase ec:1-11-1-6) آنزیمی متداول است که در بیشتر سلول های جانوری، گیاهی و بسیاری از میکروب ها یافت می شود. این آنزیم قادر است h2o2 را با به آب و اکسیژن مولکولی تبدیل می کند و به سبب پایداری قابل توجه در برابرتنش های محیطی و سهولت انبار داری، گزینه ی مناسبی برای استفاده در صنعت می باشد. باکتری kocuria asb107 جدا شده از چشمه ی رادیواکتیو آب سیاه رامسر، از جمله باکتری های مقاوم به پرتوهای یونیزان می باشد. از جمله مکانیسم های دفاعی این باکتری بومی برای مقابله با تنش های محیطی، تولید قابل ملاحظه ی آنزیم کاتالاز است. در این پژوهش، آنزیم کاتالاز از باکتری kocuria asb107 به طور نسبی خالص سازی شد. به این منظور، توده ی سلولی در فاز رشدی از زندگی باکتری که بیشترین مقدار کاتالاز را تولید می نماید جمع آوری شد و پس از یک مرحله انجماد و ذوب، تحت تیمار با آنزیم لیزوزیم شکست و عصاره ی سلولی برای تخلیص آنزیم کاتالاز، طی سه مسیر مختلف، مورد استفاده قرار گرفت. در هر مرحله از تخلیص، مقدار پروتئین با به کارگیری روش برادفورد اندازه گیری شد و فعالیت کاتالازی نمونه ها در برابر h2o2 (35mm ) در بافر فسفات (100mm, ph:7) در طول موج 240nm با تکنیک اسپکتروفتومتری پیگیری شد. در مسیر اول، آنزیم کاتالاز به ترتیب با استفاده از روش های رسوب دهی با سولفات آمونیوم 40% و 60% اشباع ، ستون کروماتوگرافی تعویض یونی deae-sepharose ، ستون ژل فیلتراسیون sephadex g-150 و سیستم جاذب هیدروکسی آپاتیت از عصاره ی خام سلولی تخلیص شد که این مسیر منجر به تخلیص 4/71 برابری آنزیم کاتالاز شد. در مسیر دوم، با جا به جایی مراحل سوم و چهارم از مسیر اول، میزان تخلیص در دو مرحله ی آخر کاهش یافت و خلوص 4/36 برابری حاصل گردید. در سومین مسیر، به ترتیب روش های رسوب دهی با سولفات آمونیوم 40% و 60% اشباع، ستون ژل فیلتراسیون sephadex g-150، سیستم جاذب هیدروکسی آپاتیت و ستون کروماتوگرافی تعویض یونی deae-sepharoseمورد استفاده قرار گرفت. در مسیر سوم، میزان تخلیص به 6.4 برابر کاهش یافت. اما در مرحله ی آخر از مسیر سوم با استفاده از ستون کروماتوگرافی تعویض یونی deae-sepharose، سه گروه مختلف کاتالاز از یکدیگر جدا شدند و رفتار کینیکی آنها بررسی شد. بر اسلس نمودار میکائلیس و منحنی lineweaver-burk،km کاتالاز گروه 1 و 2 به ترتیب (mm)2/60 و 6/15 محاسبه شد، درحالیکه vmax آنها به ترتیب (mm/min ) 42/0 و 23/0بدست آمد. فعالیت کاتالاز گروه 3 بسیار کم بود. به طوریکه vmax ظاهری آن (mm/min )018/0 گردید. به این ترتیب ، کاتالاز گروه1 برای تجزیه ی غلظت های زیاد پراکسیدهیدروژن وکاتالاز گروه 2 برای جاروب غلظت های کمتر پراکسید هیدروژن مناسب است. درمقام مقایسه، کاتالاز گروه 3 فعالیت بسیار کمتری دارد و برای کاربرد توصیه نمی شود.